科佰生物

科佰生物針對以上應用開(kāi)發(fā)對應的檢測試劑盒，配套科佰生物的參考品，對試劑盒做性能評價(jià)，如下我們以EGFR T790M為例：

待測樣本：20個(gè)陰性樣本和1個(gè)NTC。分別將投入量設置為10ng和40ng，每個(gè)樣本做兩個(gè)重復進(jìn)行Bio-Rad數字PCR檢測。

由上數據可見(jiàn)：無(wú)論是10ng還是40ng，LOB控制在2拷貝以?xún)龋ㄒ话阍胍艨截悶?/span>5以?xún)?/span>），雜點(diǎn)不呈現劑量的依賴(lài)，是隨機產(chǎn)生的噪音信號。

待測樣本：10個(gè)NGS驗證為陽(yáng)性的樣本（編號1-10）;  10個(gè)NGS驗證為陰性的樣本（編號11-20）。對20個(gè)樣本分別使用數字PCR檢測。

由上數據可見(jiàn)：

①測試10個(gè)NGS陽(yáng)性樣本,檢測結果均為陽(yáng)性，陽(yáng)性符合率100%，并定量檢出變異頻率。

②測試10個(gè)NGS陰性樣本,檢測結果均為陰性，陰性符合率100%，定值變異頻率均為0%。

1、投入量與拷貝數、頻率之間的線(xiàn)性測試

首先選取50%突變頻率的EGFR T790M標準品(CBP10402)，該標準品是通過(guò)基因編輯，二等位基因，CN=2，編輯一條為mutation，一條為WT，經(jīng)過(guò)理論值計算、Sanger測序、Bio-Rad DdPCR試劑盒（Assay ID: dHsaCP2000019）共同驗證，確認為50%的頻率。

1.1 投入量在0.1ng~200ng間設置10個(gè)梯度，進(jìn)行數字PCR檢測（2復孔），分別考量FAM拷貝數與投入量是否線(xiàn)性相關(guān)、VIC拷貝數與投入量是否線(xiàn)性相關(guān)；

1.2 投入量在0.1ng~200ng間設置10個(gè)梯度，進(jìn)行數字PCR檢測（2復孔），判斷是否滿(mǎn)足%AF=50±10%波動(dòng)。

由上數據可見(jiàn)：

①200 ng投入量過(guò)大，拷貝數不呈現線(xiàn)性，雖然滿(mǎn)足45-55%范圍，但是不適合做單一通道的拷貝數判定；

②0.1 ng投入量過(guò)小，拷貝數不呈現線(xiàn)性，同時(shí)42.59%也低于45%，不適合做單一通道，也不適合做雙通道；

因此：范圍為0.5-100ng。

2、線(xiàn)性稀釋不同頻率理論值與檢測值的線(xiàn)性測試

根據以上結論，我們選取10ng作為進(jìn)一步的%AF線(xiàn)性范圍探索，首先使用EGFR T790M的對應的陰性標準品，對50%的標準品進(jìn)行有限稀釋?zhuān)?.1%-50%間設置9個(gè)AF梯度，進(jìn)行數字PCR檢測（2復孔）。

由上數據可見(jiàn)：在10ng的投入量下，AF%呈現非常好的線(xiàn)性稀釋?zhuān)嬖诓▌?dòng)，但是都在誤差范圍內。

我們可以通過(guò)理論計算來(lái)預測下可能的檢測限范圍。當控制拷貝在15000（對應50ng input）以?xún)葧r(shí)LOB數據是2，2/15000=0.0133%，預測檢測限為0.0200%。

在如此低頻的情況下，臨床適用場(chǎng)景適合ctDNA，一般來(lái)說(shuō)臨床上10ml全血，一般中位值ctDNA是20-40ng，取最低值20ng。20ng 理論值6000個(gè)拷貝數，2/6000=0.0333%，預測檢測限為0.0500%。

0.05%的誤差范圍是±50%，就是0.025-0.075%，因此我們選擇3個(gè)點(diǎn)，探尋LOD分別為 0.010%、0.050%、0.100%，要求95%檢出。

0.010%  

對20個(gè)0.01%的樣本進(jìn)行數字PCR檢測，觀(guān)察在0.005-0.015%以?xún)仁欠襁_成95%檢出。

0.05%  

對20個(gè)0.05%的樣本進(jìn)行數字PCR檢測，觀(guān)察在0.025-0.075%以?xún)仁欠襁_成95%檢出。

0.1%  

對20個(gè)0.1%的樣本進(jìn)行數字PCR檢測，觀(guān)察在0.05-0.15%以?xún)仁欠襁_成95%檢出。

由上數據可見(jiàn)：選擇0.05%作為該檢測試劑盒的檢測限LOD。

選取強陽(yáng)性2%樣本20個(gè)，中陽(yáng)性1%樣本20個(gè)，弱陽(yáng)性0.2%樣本20個(gè)分別進(jìn)行數字PCR檢測。

由上數據可見(jiàn)：強陽(yáng)性2% 、中陽(yáng)性1% 、弱陽(yáng)性0.2%三種檢測體系下，誤差均在合理的范圍內，精密度良好。

首先使用EGFR T790M的對應的陰性標準品，對50%的標準品進(jìn)行有限稀釋?zhuān)總€(gè)梯度使用陰性樣本兩倍稀釋?zhuān)又?zhù)對11個(gè)樣本進(jìn)行檢測。

由上數據可見(jiàn)：當AF在0.05%-50%范圍內，對應的回收率在80-120%范圍，符合預期。

取10個(gè)不同AF（1%~50%）的標準品樣本，分別安排實(shí)驗員A、實(shí)驗員B在同一天，每人進(jìn)行四次檢測。

由上數據可見(jiàn)：EGFR T790M檢測體系是穩定可重復的檢出的。

取10個(gè)不同AF（1%~50%）的標準品樣本，分別安排①實(shí)驗員A、實(shí)驗員B在同一天進(jìn)行每人四次實(shí)驗測試；②實(shí)驗員A在第一天、第二天分別進(jìn)行四次實(shí)驗測試；③實(shí)驗員A在第一天進(jìn)行四次實(shí)驗測試，實(shí)驗員B在第二天進(jìn)行四次實(shí)驗測試。

由上數據可見(jiàn)：EGFR T790M檢測體系是穩定可重復的在不同人、不同時(shí)間檢出，重現的。