▏ 服務(wù)原理

研究PCR技術(shù)從1983年開(kāi)始依次經(jīng)歷普通PCR，Real-Time PCR和dPCR，現如今dPCR技術(shù)的發(fā)展就像1990年代末的Real-Time PCR發(fā)展一樣，發(fā)展迅猛。
下面我們以DdPCR為例，討論dPCR技術(shù)。

什么是DdPCR? 有什么技術(shù)特征？有哪些方面的應用？
DdPCR全稱(chēng)Droplet Digital PCR，引用bio-rad的描述為Droplet Digital PCR technology is a digital PCR method utilizing a water-oil emulsion droplet system. Droplets are formed in a water-oil emulsion to form the partitions that separate the template DNA molecules. The droplets serve essentially the same function as individual test tubes or wells in a plate in which the PCR reaction takes place, albeit in a much smaller format. The massive sample partitioning is a key aspect of the ddPCR technique.



從基本原理我們不難看出，DdPCR最大的優(yōu)點(diǎn)是絕對定量，表現為：

· 絕對定量 -ddPCR技術(shù)無(wú)需輸入標準曲線(xiàn)即可提供每個(gè)輸入樣品的目標DNA拷貝的絕對計數,使該技術(shù)非常適合目標DNA的測量，病毒載量分析和微生物定量；
· 較高的精確度 – ddPCR提供的大量樣品分配功能可以可靠地測量樣品中靶DNA序列拷貝數的微小差異；
· 提高信噪比 -稀釋高拷貝模板和背景，有效富集靶標陽(yáng)性分區中的模板濃度，從而可以靈敏地檢測稀有靶標，并實(shí)現±10％的定量精度，靈敏度可達單個(gè)核酸分子，檢測限低至0.001%；
· 消除PCR偏差 -消除qPCR的擴增效率依賴(lài)性，降低了錯誤率，可檢測到小的（1.2倍）差異，這里需要指出的是；
· 降低了耗材成本 -反應體積在皮升至納升的范圍內，減少了試劑的使用和每個(gè)數據點(diǎn)所需的樣品量，對于珍貴的樣品尤其適用；
· 降低設備成本 -基于乳液的反應系統意味著(zhù)PCR反應可以在標準的熱循環(huán)儀中進(jìn)行，而無(wú)需復雜的芯片或微流體。
· 出色的分區 -ddPCR技術(shù)每20 µl樣品可產(chǎn)生20,000個(gè)液滴，在96孔板上可進(jìn)行近200萬(wàn)個(gè)分區PCR反應，分區數量越多，精度越高。

▏ 服務(wù)應用

DdPCR技術(shù)有很多方面的應用，我們按照發(fā)表文章的領(lǐng)域，可以簡(jiǎn)單劃分為：



結合腫瘤領(lǐng)域，我們一般與之相關(guān)的有4個(gè)領(lǐng)域的應用：
1. 檢測Gene Expression，主要是檢測mRNA的定量分析；
2. 檢測Mutation（SNV和Indel），可以檢測拷貝數，也可以檢測比率；
3. 檢測CNV（拷貝數變異分析），相對定量；
4. 檢測Fusion，可以檢測拷貝數，也可以檢測比率；

▏ 案例展示

      科佰生物針對以上應用開(kāi)發(fā)對應的檢測試劑盒，配套科佰生物的參考品，對試劑盒做性能評價(jià)，如下我們以EGFR T790M為例：

 

 

實(shí)驗一：LOB空白限測試

 

 

 

待測樣本：20個(gè)陰性樣本和1個(gè)NTC。分別將投入量設置為10ng和40ng，每個(gè)樣本做兩個(gè)重復進(jìn)行Bio-Rad數字PCR檢測。

 

 

由上數據可見(jiàn)：無(wú)論是10ng還是40ng，LOB控制在2拷貝以?xún)龋ㄒ话阍胍艨截悶?/span>5以?xún)龋?，雜點(diǎn)不呈現劑量的依賴(lài)，是隨機產(chǎn)生的噪音信號。

 

 

實(shí)驗二：準確性測試

 

 

 

待測樣本：10個(gè)NGS驗證為陽(yáng)性的樣本（編號1-10）;  10個(gè)NGS驗證為陰性的樣本（編號11-20）。對20個(gè)樣本分別使用數字PCR檢測。

 

 

由上數據可見(jiàn)：

①測試10個(gè)NGS陽(yáng)性樣本,檢測結果均為陽(yáng)性，陽(yáng)性符合率100%，并定量檢出變異頻率。

②測試10個(gè)NGS陰性樣本,檢測結果均為陰性，陰性符合率100%，定值變異頻率均為0%。

 

 

實(shí)驗三：線(xiàn)性范圍測試

 

 

 

1、投入量與拷貝數、頻率之間的線(xiàn)性測試

首先選取50%突變頻率的EGFR T790M標準品(CBP10402)，該標準品是通過(guò)基因編輯，二等位基因，CN=2，編輯一條為mutation，一條為WT，經(jīng)過(guò)理論值計算、Sanger測序、Bio-Rad DdPCR試劑盒（Assay ID: dHsaCP2000019）共同驗證，確認為50%的頻率。

 

1.1 投入量在0.1ng~200ng間設置10個(gè)梯度，進(jìn)行數字PCR檢測（2復孔），分別考量FAM拷貝數與投入量是否線(xiàn)性相關(guān)、VIC拷貝數與投入量是否線(xiàn)性相關(guān)；

 

1.2 投入量在0.1ng~200ng間設置10個(gè)梯度，進(jìn)行數字PCR檢測（2復孔），判斷是否滿(mǎn)足%AF=50±10%波動(dòng)。

 

 

由上數據可見(jiàn)：

①200 ng投入量過(guò)大，拷貝數不呈現線(xiàn)性，雖然滿(mǎn)足45-55%范圍，但是不適合做單一通道的拷貝數判定；

②0.1 ng投入量過(guò)小，拷貝數不呈現線(xiàn)性，同時(shí)42.59%也低于45%，不適合做單一通道，也不適合做雙通道；

因此：范圍為0.5-100ng。

 

2、線(xiàn)性稀釋不同頻率理論值與檢測值的線(xiàn)性測試

根據以上結論，我們選取10ng作為進(jìn)一步的%AF線(xiàn)性范圍探索，首先使用EGFR T790M的對應的陰性標準品，對50%的標準品進(jìn)行有限稀釋?zhuān)?.1%-50%間設置9個(gè)AF梯度，進(jìn)行數字PCR檢測（2復孔）。

 

 

由上數據可見(jiàn)：在10ng的投入量下，AF%呈現非常好的線(xiàn)性稀釋?zhuān)嬖诓▌?dòng)，但是都在誤差范圍內。

 

 

實(shí)驗四：檢測限測試

 

 

 

我們可以通過(guò)理論計算來(lái)預測下可能的檢測限范圍。當控制拷貝在15000（對應50ng input）以?xún)葧r(shí)LOB數據是2，2/15000=0.0133%，預測檢測限為0.0200%。

 

在如此低頻的情況下，臨床適用場(chǎng)景適合ctDNA，一般來(lái)說(shuō)臨床上10ml全血，一般中位值ctDNA是20-40ng，取最低值20ng。20ng 理論值6000個(gè)拷貝數，2/6000=0.0333%，預測檢測限為0.0500%。

 

0.05%的誤差范圍是±50%，就是0.025-0.075%，因此我們選擇3個(gè)點(diǎn)，探尋LOD分別為 0.010%、0.050%、0.100%，要求95%檢出。

 

0.010%  

對20個(gè)0.01%的樣本進(jìn)行數字PCR檢測，觀(guān)察在0.005-0.015%以?xún)仁欠襁_成95%檢出。

 

0.05%  

對20個(gè)0.05%的樣本進(jìn)行數字PCR檢測，觀(guān)察在0.025-0.075%以?xún)仁欠襁_成95%檢出。

0.1%  

對20個(gè)0.1%的樣本進(jìn)行數字PCR檢測，觀(guān)察在0.05-0.15%以?xún)仁欠襁_成95%檢出。

 

由上數據可見(jiàn)：選擇0.05%作為該檢測試劑盒的檢測限LOD。

 

 

實(shí)驗五：精密度測試

 

 

 

選取強陽(yáng)性2%樣本20個(gè)，中陽(yáng)性1%樣本20個(gè)，弱陽(yáng)性0.2%樣本20個(gè)分別進(jìn)行數字PCR檢測。

 

由上數據可見(jiàn)：強陽(yáng)性2% 、中陽(yáng)性1% 、弱陽(yáng)性0.2%三種檢測體系下，誤差均在合理的范圍內，精密度良好。

 

 

實(shí)驗六：回收率測試

 

 

 

首先使用EGFR T790M的對應的陰性標準品，對50%的標準品進(jìn)行有限稀釋?zhuān)總€(gè)梯度使用陰性樣本兩倍稀釋?zhuān)又?zhù)對11個(gè)樣本進(jìn)行檢測。

 

由上數據可見(jiàn)：當AF在0.05%-50%范圍內，對應的回收率在80-120%范圍，符合預期。

 

 

實(shí)驗七：重復性測試

 

 

 

取10個(gè)不同AF（1%~50%）的標準品樣本，分別安排實(shí)驗員A、實(shí)驗員B在同一天，每人進(jìn)行四次檢測。

 

由上數據可見(jiàn)：EGFR T790M檢測體系是穩定可重復的檢出的。

 

 

實(shí)驗八：重現性測試

 

 

 

取10個(gè)不同AF（1%~50%）的標準品樣本，分別安排①實(shí)驗員A、實(shí)驗員B在同一天進(jìn)行每人四次實(shí)驗測試；②實(shí)驗員A在第一天、第二天分別進(jìn)行四次實(shí)驗測試；③實(shí)驗員A在第一天進(jìn)行四次實(shí)驗測試，實(shí)驗員B在第二天進(jìn)行四次實(shí)驗測試。

由上數據可見(jiàn)：EGFR T790M檢測體系是穩定可重復的在不同人、不同時(shí)間檢出，重現的。

 

      科佰生物已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多款dPCR試劑盒檢測體系，并利用自身的標準品進(jìn)行了性能驗證?？捎糜诨蛲蛔?，融合，拷貝數變異等的檢測。同時(shí)，我們可以提供dPCR檢測的科研服務(wù)，基于其絕對定值、精準定量的強大優(yōu)勢，為客戶(hù)的樣本檢測提供優(yōu)質(zhì)服務(wù)。